2.3 病毒感染对免疫系统影响：

  （1）引起免疫抑制。

  禽白血病病毒、马立克氏病病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性贫血病毒。

  细菌病原会引起免疫抑制→霉形体也会（少）

  很多病毒都会引起免疫抑制（多）

  （2）对免疫活性细胞的杀伤。

  如 hIV 对th 细胞具有较强的亲和性和杀伤性。

  （3）引起自身免疫性疾病。

  主要是细胞内隐蔽抗原暴露或病毒感染细胞出现新抗原，这些细胞可成为靶细胞而受到免疫细胞和免疫因子的作用，而后发生自身免疫性疾病

  分子模拟引起的自身免疫损伤

  →分子模拟指宿主细胞成分与病毒蛋白质之间存在分子结构的线性或构象同源性

  →如柯萨奇病毒是一种肠病毒——引起心肌炎

  第十八章 病毒的检测（重要）

  检测病毒的方法

  1病毒的分离培养技术

  2电镜直接检测病毒

  3免疫学方法检测病毒

  4分子生物学方法检测病毒

  5其他（流式细胞术、基因芯片技术、蛋白质芯片）

  分离与鉴定不一样

  第一节 病毒的分离和鉴定（到底什么病毒，是否具有致病性）

  1病毒分离培养是诊断病毒性疾病金标准，特异性强，能发现新病毒，反应传染性，可在实验动物中验证。

  2不足：

  （1）耗时长，一般只能做回顾性诊断

  （2）成本和技术要求高，敏感性不高

  （3）有些病毒无法或极难培养

  （4）不同的病毒需要不同的分离方法

  1.分离病毒的病原学意义

  1从机体组织、脑脊液、血液、眼部、水泡液分离到任何病毒均可认为具有高度病原学意义；尿液中检出病毒也有病原学诊断意义。

  2从呼吸道、阴道、肠道标本分离病毒的病原学意义需考虑这些病毒是否有无症状携带者和长期排毒者。

  3如果同时从同一发病动物的多个部位分离到同一种病毒，其病原学意义较大；如果仅从某种标本分离到病毒，病原学意义则较小。

  4分离培养呈阴性结果时，应考虑的因素：

  （1）细胞的敏感性

  （2）是否有细菌或真菌的污染

  （3）是否接种量或病毒含量过低等

  5结合恢复期与急性期血滴滴度之比判断所分离到的病毒与某一特定疾病的关系。

  （分离到微生物并不能说明为本次疫病病原，要做动物实验）

  2.病毒的分离与鉴定的基本过程：

  1病毒材料的采集与准备

  2病毒的分离与培养

  3病毒的理化特性测定

  4病毒的血清学鉴定

  5病毒的分子学鉴定等

  2.1 病毒材料的采集与准备

  病料采集：

  1病料采集适当与否，直接影响病毒的检测结果。

  2一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等，主要因动物及病毒种类而异。

  病料的处理：

  1采集的器官或组织样本

  2分泌物或渗出液、粪便

  3咽喉拭子

  （支原体、衣原体、立克次体过滤不能除去）

  2.2 病毒的分离与培养：

  1实验动物

  2鸡胚

  3细胞培养→最常用于病毒分离培养的方法

  （朊病毒，疯牛病目前无法培养）

  2.2.1 动物接种：

  1最原始方法

  2分离和鉴定病毒

  3增殖病毒以制备抗原和疫苗

  4病毒实验研究

  常用动物：本动物（马、牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅） 小白鼠、豚鼠、家兔、鸽子

  接种途径：

  鼻腔内、皮内、皮下、腹腔、静脉、肌肉、脑内

  （接种最多：肌肉、皮下、黏膜）

  动物接种优点和缺点

  优点：操作简便

  缺点：

  1动物体内存在特异性抗体

  2动物体内带有病毒（可通过使用无菌动物解决）

  2.2.2 鸡胚培养：

  一般用 9~12 日龄鸡胚

  1绒毛尿囊膜

  2尿囊腔

  3羊膜腔

  4卵黄囊

  5脑内

  6静脉

  很多哺乳类病毒不在鸡胚上生长（不适应）→牢记！！实验需掌握

  鸡胚培养病毒的优点和缺点

  优点：经济、简便、鸡胚易得

  缺点：

  1有些鸡胚带有母源抗体

  2也可能带有病毒

  3很多病毒在鸡胚中不生长

  2.2.3 细胞培养：

  1将离体活组织块或分流的活细胞加以培养统称为组织培养，后者又称单层细胞培养。

  2细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

  细胞培养的特点：

  （1）细胞的生理特性基本一致

  （2）对病毒的感染性一致

  （3）没有实验动物的个体差异

  （4）重复性好

  （5）与实验动物相比，通过观察细胞病变或结合免疫学技术检测判断结果。

  （6）可通过病毒细胞培养产生的空斑进行克隆纯化病毒。

  细胞培养的类型

  根据细胞的来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型:

  （1）原代细胞

  （2）二倍体细胞株

  （3）传代细胞系

  原代细胞：

  1动物新鲜离体组织块（剪成小块）经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，再生长与培养器皿中。

  2有人把培养的第 1 代细胞与传 10代以内细胞统称为原代细胞。

  3分离病毒最为敏感，尤其是本动物的原代细胞。

  二倍体细胞株：

  1将长成的单层原代细胞消化分散成单个细胞继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样保持其二倍体型的染色体，称为二倍体细胞。

  2如：猪肾细胞系（pK-15）、犬肾细胞系mdcK。

  3可传至一百代左右

  4用于病毒分离和疫苗制备

  传代细胞系：

  1能在体外持续增殖传代的细胞系，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而来

  2方便易得

  3用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。

  常用的细胞培养类型

  原代细胞:恒河猴肾细胞、人胚肾、肺等细胞，鸡胚成纤维细胞

  二倍体细胞株:猪肾细胞系（pK-15）、恒河猴胚细胞株（hL-8）、犬肾细胞系

  传代细胞系:hela 细胞、detroit 细胞（胸骨髓细胞系），chang c\/I\/L\/K（人结膜 c、肠 I、肝 L 与肾 K 细胞系），Vero（绿猴肾细胞系），bhK-21（幼地鼠肾细胞系）

  3.病毒理化特性的测定

  （1）病毒核酸型鉴定（单股\/双股 dNA\/RNA 正链\/负链 新病毒→逐渐缩小范围）

  1卤化核苷酸法→检测为 dNA 还是 RNA 病毒

  2放线菌素 d 法

  3吖啶橙（Ao）染色法

  4绿豆芽酶：

  该酶可降解单核酸，可以测定核酸的股数

  （2）耐酸性试验

  （3）脂溶性试验

  （4）耐热性试验等

  4.病毒的血清学和分子生物学鉴定

  1病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对分离毒株进行血清学鉴定，已确定病毒的种类、血清型及其亚型。

  2分子生物学技术鉴定病毒

  第二节 病毒感染单位的测定

  1测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度是病毒学中最重要的技术之一。

  2病毒滴度可以通过用稀释的病毒接种细胞培养、鸡胚或实验动物，检测其增殖情况而确定。

  3常用于病毒滴度测定的技术有空斑试验、终点稀释法等。

  终点稀释法：

  （1）用途：

  1测定病毒滴度

  2确定病毒对动物的毒力或毒价

  （2）方法：

  将病毒做系列稀释，选 4~6 个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或动物，每个稀释度做 3~6 个重复

  →问 tcId50、Id50、Ld50、ELd50、EId50

  第三节 病毒颗粒的检测

  1电镜技术常用于直接检测病毒颗粒

  2用血凝试验和病毒酶活性测定

  电镜技术：

  1最直观观察病毒颗粒的方法。但 Em 检测样本中必须有一定量的病毒颗粒，如少于 107\/ml 则不易检出

  2可用磷钨酸盐等重金属盐直接做负染而后观察，适用于观察病毒表面结构。

  3器官组织样本则须做超薄切片后再做负染观察。可观察细胞内的病毒结构，如冠状病毒、逆转录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。